Место цитогенетического мониторинга в системе исследования загрязнения окружающей среды. Методы цитогенетического мониторинга

Введение

В состав генетического мониторинга входит цитогенетический мониторинг, задачей которого является регистрация возникающих под действием антропогенных факторов изменений в структуре генофонда и прогнозирование темпов ее перестройки[3]. Но цитогенетический мониторинг может быть использован не только как составляющая часть генетического мониторинга. В экологическом мониторинге он дополняет генетические данные и результаты исследований по воздействию загрязнителей и позволяет решить две задачи: составить полную картину при экспертизе биологических последствий загрязнения, оценить роль антропогенных воздействий на стабильность сортов растений, от которых зависит их продуктивность[1].

Мутационный груз, возникающий в растительных популяциях в результате влияния антропогенной нагрузки, можно сравнительно быстро определить с помощью современных цитогенетических методов, используя один из основных цитогенетических критериев - частоту клеток с перестройками хромосом в первых митозах меристемы корней. Это позволяет установить различия между популяциями из загрязненных и контрольных районов[2]. Учет аберраций хромосом можно проводить на стадии метафазы (метафазный метод) или на стадии поздней анафазы и ранней телофазы (ана-телофазный метод). Оба метода имеют как преимущества, так и недостатки.

Метафазный метод более точен. Он дает возможность выявить в 1,5 раза больше мутаций и позволяет учесть с предельной точностью все типы хромосомных и хроматидных перестроек, а также геномные мутации. Вместе с тем он является достаточно трудоемким и связан с определенными ограничениями в выборе объектов для исследований. Так, наиболее результативен он при использовании видов с небольшим числом крупных, хорошо идентифицируемых хромосом. Создаются затруднения при изготовлении давленых препаратов высокого качества [4].

При использовании ана-телофазного метода для анализа пригодна почти каждая делящаяся клетка. Этот метод менее точен. Он позволяет учесть лишь некоторые типы хромосомных аберраций. Его принято считать экспресс-методом для предварительной оценки активности тех или иных агентов. Тем не менее, ана-телофазный метод широко применяется для выявления мутагенных эффектов [5].
 

1. Учет хромосомных аберраций в митозе и механизмы их образования

В основе структурных перестроек лежит свойственная всем хромосомам способность при определенных условиях разрываться на части, фрагментироваться [6].Происхождение и судьба разных типов аберраций хромосом неодинакова. Одним из наиболее важных факторов принято считать установление зависимости между митотическим циклом и реакцией хромосом на действие антропогенной нагрузки. В результате антропогенного воздействия на хромосомы на разных стадиях ядерного цикла образуются разные типы перестроек, которые обусловлены, в основном, самой структурой хромосом в каждой данной стадии. В стадии G1 хромосома ведет себя как отдельная нить. Возникают межхромосомные обмены, кольца, хромосомные делеции и сложные хромосомные перестройки. В стадию S хромосома обнаруживает двойственную структуру, субнити которой ведут себя самостоятельно, образуя полухроматидные концевые делеции, полухроматидные межхромосомные обмены (транслокации), полухроматидные интерстициальные делеции (микрофрагменты), изо- полухроматидные делеции, а также полухроматидно-изополухроматидные трирадиалы.

В стадию G2 образуются хроматидные перестройки: концевые делеции, изосестринские делеции, симметричные и ассиметричные межхромосомные хроматидные обмены, трирадиалы[7]. При повреждении двухроматидной хромосомы образуется ацентрический фрагмент и укороченная хромосома. Если при соединении разорванных концов исходная структура восстанавливается, то никаких перестроек не происходит. При двух близких одновременных разрывах случайное соединение четырех свободных концов обуславливает различные аберрации обменного типа. В анафазе - телофазе митоза фрагмент обнаруживается между полюсами. Судьба фрагментов ( одиночных и множественных) различна. Они могут попасть в одно из дочерних ядер, резорбироваться или образовывать дополнительное микроядро[8]. Мост является следствием фрагментации двух хромосом. При воссоединении фрагментов, содержащих центромеры, образуется дицентрическая хромосома, которая испытывает воздействие обоих митотических центров, и, растягиваясь между дочерними группами анафазных-телофазных хромосом, образует мост. Аналогично на стадии G2 и S образуется хроматидный мост [9].

Отставания хромосом в метакинезе и при расхождении к полюсам возникают при повреждении хромосомы в области кинетохора. Или это может быть связано с действием антропогенных веществ на мембраны митохондрий так, что из этих органелл в цитоплазму выходит кальций. Повышения уровня кальция может подавлять формирование белковых микротрубочек, а следовательно, и образования митотического веретена. Окончательным итогом будет нерасхождение хромосом в митозе. Отставшие хромосомы либо разрушаются и элиминируют из клетки, либо формируют дополнительное микроядро[10].

Перестройки хромосом (хромосомные аберрации, хромосомные мутации) подразделяют на два основных типа: симметричные и асимметричные. Первый тип связан с образованием в результате перестройки отдельных хромосом с одной центромерой, второй - с появлением ацентрических и дицентрических фрагментов.

При анализе перестроек в анафазе учитываются лишь асимметричные перестройки: фрагменты, кольца ( замкнувшиеся фрагменты, образовавшиеся в результате двух разрывов), хромосомные и хроматидные мосты. Мосты могут быть образованы дицентрическими хромосомами, возникающими либо в результате транслокаций, либо изохроматидных делеций. Могут возникать мосты также из дицентрических колец [11].

2. Мейотический тест и его использование в цитогенетическом мониторинге

Ввиду большой чувствительности к внешним воздействиям, мейоз представляет собой удобную систему для генетического мониторинга [12]. Анализ мейоза может дать наиболее полную информацию о генетических последствиях тех или иных воздействий на растения. Клетки спорогенной ткани дифференцируются на ранних стадиях онтогенеза и развиваются в течение всего жизненного цикла растения. Большие размеры ядра и хромосом в профазе мейоза и большая продолжительность мейоза по сравнению с митозом, что делает ядро в стадии мейоза более чувствительным к антропогенной нагрузке. Кроме повышения уровня аномалий в мейозе, увеличивается частота полностью стерильных растений. Отмечено уменьшение числа археспориальных клеток в пыльниках, дегенеративное изменение пыльцы [13] .

2.1.Влияние ионизирующего излучения на частоту хромосомных аберраций в мейозе

Чувствительность клеток к излучению может быть разной в связи с различным физическим состоянием молекул в протоплазме. Это обстоятельство имеет большое значение, так как в различные периоды жизнедеятельности клетки физические свойства ее макромолекул и структур меняются.

Опыты по использованию микропучков для облучения отдельных структур и участков клетки показали, что наиболее губительно излучение действует на ядро и хромосомы. В облученных клетках происходят обратимые и необратимые изменения: пикноз ядра, склеивание хромосом, фрагментация хромосом, образование гигантских ядер и многоядерных клеток, нарушение полярности делений, возникновение ядер с различным числом хромосом. Частота и характер хромосомных аберраций зависит от дозы облучения и от того, в какой период митотического и мейотического циклов было произведено облучение. Воздействие возможно в двух состояниях хромосом: 1) на недуплицированные хромосомы (интерфаза, период G1); 2) на дуплицированные хромосомы (профаза, метафаза, период G2 ).

Облучая микроспоры традесканции рентгеновскими лучами, Сакс установил, что при этом возникают простые терминальные делеции и изохроматидные аберрации, частота которых линейно возрастала с увеличением дозы. Выход таких аберраций не зависел от фактора времени. Результаты этих опытов позволили Саксу заключить, что разрывы хромосом, происходящие при облучении, не зависят друг от друга, и частота их прямопропорциональна дозе облучения. Предполагалось, что часть разрывов может остаться невоссоединенной и явиться причиной делеций. Большая же их часть воссоединяется, восстанавливая исходную структуру, а при неправильном слиянии приводит к обмену фрагментами. Обычно в обмене участвуют те разрывы, которые находятся в непосредственной близости друг от друга[14].

Сейчас есть данные о том, что цепи ДНК в процессе репликации подвергаются разрывам. Если эти разрывы заживляются при участии ферментов, осуществляющих пострепликативное восстановление после облучения или последние этапы восстановления по механизму выщепления ресинтеза, то мутации чувствительности к ионизирующим излучениям должны вести к увеличению спонтанной летальности или спонтанной мутабельности.

По классической теории образования аберраций радиация вызывает множество разрывов хромосом,значительная часть которых соединяется.Большинство оставшихся разрывов вовлекается в обмен,а остальные проявляются в метафазе.Таким образом,разрывы хромосом и хроматид рассматриваются как последствия первичного радиобиологического эффекта,который реализуется в ходе интерфазы [13].

Предполагается, что хромосомный тип аберраций возникает при действии облучения до репликации хромосом, а хроматидный - при облучении реплицированных хромосом. Многими исследователями доказано, что период S разделяет время образования хромосомных и хроматидных аберраций. Иначе говоря, облучения в пресинтетический период вызывает аберрации хромосомного типа, а в постсинтетический - хроматидного типа. С наступлением синтетического периода частота хромосомных разрывов резко снижается, а хроматидных - возрастает.

Единственным точным методом оценки действия радиации на живые клетки является прижизненное наблюдение облученных клеток. В данном случае можно непосредственно установить контроль за определенной клеткой сразу после облучения и без малейших погрешностей определить фазу на которой она была облучена. В тех случаях, когда непосредственного наблюдения за облученными клетками установить нельзя, прибегают к фиксации материала через определенное время после облучения. Поскольку учет перестроек хромосом можно производить только в метафазе, анафазе и ранней телофазе, то зная время в момент облучения и в момент фиксации, а также продолжительность каждой фазы, можно высчитать, в какой фазе была облучена клетка [16]. Нужно знать, сколько времени продолжается каждая фаза в цикле клеточного деления каждого растения. Например, для лука репчатого при 20 °С интерфаза продолжается 20 - 26 часов, от ранней профазы до анафазы проходит два часа, анафаза и телофаза вместе длятся около 45 минут, весь цикл деления клетки продолжается 23 - 29 часов. В другом литературном источнике указаны иные данные: общая длительность митотического цикла у Allium cepa составляет 13-15 часов при температуре 24-25 °С.

Зная длительность промежутка времени от момента облучения до фиксации и наблюдая состояние клетки после фиксации можно определить, в какой фазе находилось ядро клетки во время облучения. Пыльник обычно содержит до 1000 клеток, пригодных для наблюдения. Поскольку различные бутоны в одном соцветии содержат микроспоры в последовательных фазах развития, то при одной экспозиции можно обработать клетки на различных стадиях.

2.2 Действие кислорода. Кислородный эффект

Кислород, находящийся в среде, может значительно усилить действие облучения. При удалении кислорода чувствительность к облучению уменьшается в два-три раза. Это так называемый кислородный эффект, и его, по-видимому определяют клеточные мембраны.

Фетнер в 1956 году изучал на микроспорах традесканции влияние кислорода на возникновение делеций и перекомбинаций фрагментов (дицентрические и трицентрические хромосомы, центрические кольца). При облучении дозами 200 и 400 рентген наблюдалось увеличение процента как делеций, так и обменов. Автор считает, что в отсутствие кислорода происходит меньше разрывов, а возникшие фрагменты реже перекомбинируются [17].

В опытах Джайлса и его сотрудников на микроспорах традесканции было обнаружено следующее:

) наличие кислорода приводит к увеличению числа хромосомных перестроек всех типов, другие газы влияния не оказывают;

) кислород эффективен лишь в том случае, когда он присутствует в клетке во время облучения. Введение его до и непосредственно после облучения никакого эффекта не дает. Кислород без облучения также не эффективен (хотя в литературе имеются данные, говорящие о возникновении хромосомных перестроек в хромосомах пыльцевых зерен при действии одного кислорода;

) даже при полном отсутствии кислорода (поскольку таковое может быть достигнуто в условиях опыта) наблюдается значительное количество перестроек.

.3 Факторы среды и другие неучтенные факторы

В ходе мейоза возможны различные нарушения, причиной которых могут быть окружающие условия или генетические особенности организмов. У растений нарушения мейоза чаще всего возникают при изменение температуры. После изучения механизма действия температуры на формирование аберраций стало ясно, что повышение температуры, как и понижение, приводит к изменению интенсивности всех физиологических процессов клетки. Очевидно, в каждом конкретном случае температурный эффект может быть различным. Есть данные , что частота аберраций у микроспор традесканции увеличивается в 4 раза при облучение их рентгеновскими лучами в условиях пониженной температуры.

Нарушения мейоза у растений могут быть вызваны и заболеваниями. Например, у растений желтого люпина, больных узколистностью ( вирусное заболевание ), отмечено появление унивалентов, отстающих хромосом и анафазных мостов. В такие же нарушения в мейозе могут возникнуть при голодании и недостатке воды в почве.

У некоторых растений нарушения в мейозе ежегодно встречаются в больших количествах. Так, у Anemona nemorosa микроспорогенез всегда происходит при очень низкой температуре (около 0 °С) и поэтому во многих микроспороцитах в ходе мейоза имеются нарушения. Нарушения мейоза у растений могут быть обусловлены не только погодными условиями, но и особенностями опыления.

В ходе процесса мейоза возможны отклонения и нарушения, которые могут быть связаны с цитогенетическими и физиологическими особенностями организмов, а также с внешними условиями. Некоторые авторы отмечают, что частота нарушений в мейозе зависит не только от температурных условий, в которых произрастают растения, но и от особенностей сорта и от их урожайности.

Некоторые отклонения от общей схемы мейоза стали нормой для ряда видов растений. Хорошо известно, что в ходе микроспорогенеза у цветковых растений, как правило, почти все микроспороциты в норме проходят мейоз, и все 4 продукта мейоза являются функционально нормальными, то есть образуют мужской гаметофит. Однако из этого правила есть исключения. У представителей некоторых родов растений (Swertia, Holoptelia, Ophiopogon, Zostera) многие потенциальные микроспороциты не проходят мейоз, а дегенерируют, по-видимому, выполняя трофическую роль, так как в пыльниках этих растений слабо развит тапетум. В этих случаях часть спорогенных клеток компенсируют недостаточность функционирования тапетума. Иногда, как у Kigelia, дегенерация происходит на стадии тетрад микроспор.

Таким образом, изучение мейоза, особенно при исследовании природных популяций растений ограничено тем, что он чувствителен к неблагоприятным климатическим факторам, среди которых основную роль играют недостаток влаги или ее быстрое испарение и повышенная температура.
 

2.4 Микроспорогенез как показатель в оценке действия загрязнителей среды

Анализ литературных данных показал, что микроспорогенез растений является распространенным методом биоиндикации загрязняющего воздействия среды промышленными отходами и выбросами. В качестве тест-объектов используются различные растения, но наиболее чувствительными являются Tradescantia sp. , Acer platanoides L. , Vicia cracca L., Vicia faba.

Патологические микроспоры характеризуются неравномерной окраской цитоплазмы, плазмолизом, высокой гидрофильностью ядра и рядом других признаков, наблюдаемых при формирование пыльцевых зерен. Патологические изменения, появляющиеся на всех стадиях мейоза, значительно снижают формирование полноценной жизнеспособной пыльцы. Высокий процент пыльцы у растений, произрастающих в зоне продолжительных загрязнений среды, оказывается стерильной ( до 50% пыльцы ). В целом, для популяции это означает уменьшение генетического разнообразия и как следствие - снижение адаптивных возможностей. Анализ нарушений микроспорогенеза позволяет оценить факторы, действующие длительно, хотя и в малых дозах, и, по сути дела, включенные в микроэкологический фон популяции. Таким образом, аномальное протекание мейоза в микроспороцитах и количество стерильной пыльцы - хороший тест в системе биоиндикации загрязнителей среды[18].

2.5 Митотическая активность как показатель антропогенной нагрузки в системе цитогенетического мониторинга

Митотическая активность клеток крайне важна для нормальной жизнедеятельности организма и нередко используется исследователями в качестве чувствительного показателя в оценке загрязненности окружающей среды. По изменению митотической активности в ту или иную сторону можно судить о степени мутагенного воздействия на окружающую среду.

Митотическая активность оценивается с помощью определения митотического индекса (МИ). Анализ литературы позволяет сделать вывод о том, что в большинстве случаев снижение митотического индекса в исследуемых популяциях растений указывает на негативное влияние загрязнений окружающей среды на хромосомный аппарат [17]. Однако есть предположения, что снижение митотической активности может быть связано с интегральным эффектом природно-климатических факторов: повышение температуры, избыток или недостаток влажности. Повышение митотического индекса связано с увеличением доли клеток на всех стадиях митоза. Такое явление наблюдается в популяциях растений, подвергающихся небольшим стрессовым воздействиям, обуславливающим стимулирующий эффект. При сильных стрессовых воздействиях, особенно мутагенной природы, наблюдается обратный эффект.

В целом, популяции растений, произрастающие в экологически чистых условиях, имеют более высокие показатели митотической активности, чем растения из антропогенно-трасформированных популяций. Средний митотический индекс - соотношение количества делящихся клеток и всех клеток зоны деления. Величина среднего МИ может значительно варьировать в разных корнях одного вида. Характерно, что в корнях, в которых МИ оказывается высоким для одной ткани, индекс других тканей может быть низким. Наблюдения за изменением митотической активности и длительностью каждой фазы митоза дают представление только о качественной стороне изменения продолжительности цикла и синхронности деления. Более высокий МИ при неизменном соотношении фаз деления свидетельствует о том, что клетки ускоренно проходят митотический цикл. Более низкий МИ и одновременное увеличение количества клеток в некоторых фазах свидетельствует о том, что клетки медленнее проходят эти фазы митоза [18].

Снижение доли профаз и метафаз происходит только в самом конце зоны митозов, а ближе к кончику корня МИ, как правило, увеличивается без изменения соотношения фаз. Это показывает, что при уменьшении МИ здесь не меняется продолжительность фаз митоза. Уменьшение же МИ в базальном конце меристемы бесспорно связано с окончанием митозов и переходом к интенсивному растяжению. Для Allium cepa L. доказаны суточные ритмы митотической активности [19].

2.6 Разработка шкалы чувствительности критериев цитогенетического мониторинга

Исследования нарушений митоза и мейоза позволяют выявлять ранние изменения цитогенетической системы организма и прогнозировать ее состояние в меняющихся условиях. Применение ряда критериев цитогенетического мониторинга на одном тест-объекте расширяет пределы его чувствительности и позволяет уменьшить количество тест-систем и объектов для адекватной оценки влияния поллютантов ( Калаев В.Н., 2000 ). Необходимо выявить чувствительность различных цитогенетических показателей для создания шкалы критериев, по изменению которых можно оценивать силу воздействия загрязнителей на биообъекты.

Широкое распространение для оценки степени генетического риска для человека получили методы цитогенетического мониторинга (ЦМ), позволяющие определить суммарную нагрузку, являющуюся интегральным показателем эффекта сложнейших комбинаций мутагенов и их модификаторов. На тест-объектах, как правило, применяется один из критериев, используемых в ЦМ: митотическая активность (МА), частота и спектр патологий митоза (ПМ), ядрышковая активность (ЯА), частота сестринских хроматидных обменов, количество хромосомных аберраций, микроядерный тест (МТ). Каждый из критериев имеет свои преимущества и недостатки, различную чувствительность к стрессовым воздействиям. Поэтому применение их по-отдельности не всегда позволяет точно оценить эффект загрязнителей. Применение батарей тестов значительно усложняет определение интегральной оценки загрязнения. Для решения проблемы предлагается использовать не один, а несколько критериев на одном тест-объекте [20].

Анализ результатов эксперимента, проведенного учеными Воронежского государственного университета на модельном объекте Zebrina pendula Schirt (облучались радоном ее отростки), и анализ литературных данных позволил им сделать вывод о том, что наиболее чувствительным цитогенетическим критерием является ЯА. Далее в порядке убывания чувствительности: появление остаточного ядрышка на стадии метафазы-телофазы митоза, стимуляция МА, изменение спектра ПМ, увеличение их числа, микроядерный тест, депрессия МА.

Рисунок 1 - Шкала чувствительности критериев цитогенетического мониторинга [20].
 

Заключение

Цитогенетические показатели как и любые другие у живых организмов, характеризуются изменчивостью, обусловленной генотипическими особенностями организмов и колебаниями условий среды, например, погодных условий. Если показатели температуры и влажность не выходят за пределы нормы, типичной для данного региона, вызываемые ими изменения не снижают жизнеспособности организмов, т.к. они обеспечивают возможность для осуществления репаративных процессов. Пределы изменчивости цитогенетических показателей в таком случае также можно рассматривать как нормальное. Знание их важно для сравнения с таковыми в условиях антропогенного загрязнения, что позволяет оценить степень загрязнения среды и генетического риска для человека.
 

Список литературы

. Ваулина Э.Н. и др., 1977; Турков В.Д. и др.,1990; Глотов Н.В.и др., 1995.

. Шумный В.К. и др., 1993.

. Бурдин К.С., 1985; Дмитриева С.А., Парфенов В.И., 1991.

. Шарма А., 1989; Sharma A., 1985.

. Дмитриева С.А., Парфенов В.И., 1991; Holub Z. et al., 1986.

. Ивенс Х., 1966; Соколов Н.Н., Сидоров Б.Н.,1969.

. Мекшенков М.И.,1962;Бостон К.,Самнер Э., 1981.

. Белецкий Ю.Д.и др.,1966;Корытова А.И., Михайлов О.Ф., Яцук Н.А., 1985.

. Алов И.А., 1972; Дубинин Н.П. и др., 1980; Яблоков А.В. А.В.Остроумов С.А., 1985.

. Мекшенков М.И., 1962.

. Вольф В.Г., 1958 .

. Захаров И.А.,1970.

. Бондарь Л.М., Частоколенко Л.В., 1990

. Бондарь Л.М., Частоколенко Л.В. и др., 1991.

. Цитленок и соавт., 2002

. Делоне Н.Л., 1960 .

. Балодис В.А., 1968

. Гриф В.Г., Иванов В.Б., 1975.

. Калаев В.Н., 2000.