Выявлены гены, отвечающие за содержание сахаров в яблоках
Рис. 1. Состав яблока
Большинство известных на данный момент сортов яблок (более семи тысяч) относятся к одному-единственному виду — яблоне домашней (Malus domestica). Судя по молекулярным данным, этот вид произошел от яблони Сиверса, произрастающей и сейчас на территории современного южного Казахстана и Киргизии (R. Velasco et al., 2010. The genome of the domesticated apple (Malus × domestica Borkh.)). Предполагается, что яблоня Сиверса попала в Европу благодаря походам Александра Македонского в IV веке до н. э. В Древней Греции она была одомашнена, были выведены первые культурные сорта, на территорию Руси яблоня домашняя попала только в XI веке. Однако другие виды дикой яблони человек знал и повсеместно использовал еще с неолита. Сейчас известно более 60 видов яблонь, многие из них скрещивают с яблоней домашней для выведения новых сортов, а некоторые (например яблоня китайская) ценятся и сами по себе: за плоды или в качестве декоративных растений.
Качество сортового яблока во многом зависит от его вкуса: в первую очередь от соотношения сахаров и кислот в его составе. Основные сахара в яблоке это фруктоза, сахароза, глюкоза и сорбит. Основные кислоты — яблочная, лимонная и винная (рис. 1).
Недавние исследования показали, что современные сорта яблок вопреки ожиданиям содержат столько же сахара, сколько и их дикие родственники. Однако, одомашнивание яблони привело к изменению соотношения разных сахаров: снизилось количество фруктозы и глюкозы, а содержание сахарозы возросло примерно в 4 раза. Общее количество сахара и индекс сладости яблока (рассчитывается из свойств сахаров, их количества и соотношения) остались неизменными (рис. 2). Заметные же для любого из нас различия во вкусе обеспечены снижением количества яблочной кислоты в 2,2 раза по сравнению с дикими родственниками (B. Ma et al., 2015. Comparative assessment of sugar and malic acid composition in cultivated and wild apples).
Рис. 2. Сравнение состава зрелых яблок 43 диких видов/сортов яблони (обозначены буквой W) с яблоками 321 сорта яблони домашней (обозначены буквой C). Показано содержание (в мг/г) сахарозы (Sucrose), глюкозы (Glucose), фруктозы (Fructose). Видно, что общее количество сахаров (Total soluble sugar) и индекс сладости (Sweetness index) у диких и сортовых яблок примерно одинаковые, а яблочной кислоты (Malic acid) мякоти свежего яблока. Рисунок из статьи B. Ma et al., 2015. Comparative assessment of sugar and malic acid composition in cultivated and wild apples
Новые сорта яблок — более плодовитые, более устойчивые к заболеваниям и, конечно, более вкусные — продолжают выводить и сейчас. Это дело требует много времени и сил: только на двенадцатом году жизни яблоня обычно дает первый урожай. И даже если прививать черенки, то до первого яблока пройдет скорее всего не меньше четырех лет. При этом вполне может оказаться, что вкусовые качества плодов оставляют желать лучшего и в дальнейшее разведение эта яблоня не годится. Но если будет возможность проверять растения на качество их плодов еще на стадии проростков и отметать те из них, которые потом заведомо дадут брак, то выведение новых сортов будет значительно оптимизировано.
Если понять, от каких генов зависит содержание тех или иных веществ в зрелом яблоке (например, сахаров), можно будет справиться и с некоторыми другими проблемами классической селекции. Дело в том, что вкус яблока и даже содержание конкретного типа сахара в плоде очень зависит от внешних условий (погоды, свойств почвы и т. д.), которые невозможно проконтролировать полностью. Кроме того, свойства каждого плода зависят еще и от генов попавшей на цветок пыльцы, происхождение которой далеко не всегда можно установить. В итоге, качество яблок на одной и той же яблоне в один и тот же сезон может сильно варьировать, не говоря уже о различиях между яблоками разных годов. Поэтому для получения относительно достоверных данных о качестве яблони, необходимо проанализировать не один десяток яблок с нее, причем в разные годы, что и было проделано авторами упомянутой выше статьи. Анализ же генотипа яблони даст нам представление о ее «склонности» давать более или менее сладкие яблоки, без искажения результатов.
Сахара в растениях (прежде всего глюкоза) образуются на последнем этапе фотосинтеза. Несмотря на то, что в самих яблоках этот процесс почти не идет, по мере созревания они становятся довольно сладкими (гораздо слаще листьев, в которых фотосинтез как раз идет очень активно). Дело в том, что образующиеся в зеленых листьях сорбит и сахароза постоянно транспортируются в плоды: из листьев сахара попадают во флоэму — сосудистую систему растения — и в виде раствора разносятся по всему организму. В зреющем (а потом и в опавшем) яблоке сорбит под действием ферментов яблока постепенно преобразуется во фруктозу, а сахароза постепенно распадается на фруктозу и глюкозу. При этом количество и соотношение сахаров зависят от активности их транспорта от листьев к флоэме, от флоэмы к плодам и от одних тканей плода к другим.
Недавно была открыта группа белков-транспортеров сахаров — SWEET, играющая решающую роль в переносе сахаров в растениях при созревании плодов, выделении нектара и многих других процессах. Они обеспечивают введение и выведение сахаров из клеток, без них передача сахаров во флоэму и захват их тканями яблока из флоэмы не были ли бы столь эффективными. Сходные белки имеются у бактерий и животных, они участвуют в распределении питательных веществ еще со времен нашего общего предка (J.-S. Eom et al., 2015. SWEETs, transporters for intracellular and intercellular sugar translocation).
Группа исследователей из Китая поставила перед собой задачу выявить гены белков SWEET, по которым можно было бы анализировать качество будущего урожая задолго до первого цветения яблони. Для начала они проанализировали геном яблони домашней и нашли в нем гены, по структуре соответствующие семейству SWEET-генов. Было найдено 25 MdSWEET-генов (первые две буквы — от видового названия яблони домашней), каждый из которых, вероятно, играет свою роль в транспорте сахаров в растении.
У общего предка всех яблонь когда-то было лишь 9 пар хромосом, которые затем удвоились с потерей одной из пар. В результате все современные яблони имеют 17 пар хромосом, 8 из которых гомологичны (то есть содержат сходные гены — паралоги) другим восьми. В связи с тем, что нам известно, какие именно хромосомы являются друг другу гомологами, мы можем проследить и то, какие SWEET-гены произошли друг от друга и являются соответственно паралогами (рис. 3). Так, к примеру, гомологичными являются хромосомы под номерами 3 и 11: на конце третьей хромосомы имеется ген MdSWEET2a, а на конце одиннадцатой хромосомы — ген MdSWEET2b, они паралоги. Однако также на одиннадцатой хромосоме в непосредственной близости от этого гена имеется еще один — MdSWEET11, не имеющий близнеца на третьей хромосоме. Авторы предполагают, что такая картина является результатом дупликации гена на 11 хромосоме, то есть у предка яблони была сначала лишь одна из этих двух хромосом с геном MdSWEET2, затем произошло удвоение набора хромосом и теперь уже у двух пар хромосом (3-й и 11-й) имелся этот ген. Со временем гены на разных парах хромосом накопили различия в строении и стали выполнять немного разные функции, хотя и остались очень похожими (поэтому их и назвали 2а и 2b).
Рис. 3. Расположение MdSWEET-генов на хромосомах яблони. Рисунок из обсуждаемой статьи в Horticulture Research
Такой путь прошли все имеющиеся в гомологичных друг другу парах хромосом гены. Однако именно у 3-й и 11-й пар хромосом, судя по всему, произошло еще одно событие: в какой-то момент участок 11-й хромосомы, содержащий ген MdSWEET2, удвоился. Хромосома удлинилась, появился еще один паралог MdSWEET2гена и тоже стал изменяться со временем. Этот ген и получил теперь название MdSWEET11. Предположительно, такое же удвоение или дупликация участка хромосомы произошло на 13-й паре хромосом, также имеющей два SWEET-гена, соответствующих одному гену на гомологичной 16-й паре. А вот у 17-й пары хромосом SWEET-ген оказался без пары на соответствующей ей 9-й паре. Похоже, что на 9-й паре хромосом произошло обратное событие: фрагмент хромосомы, содержавшей SWEET-ген был случайно утерян — произошла его делеция.
Белки SWEET и кодирующие их гены изучены довольно плохо, полный их список для растений есть только по резуховидке Таля(Arabidopsis thaliana). Поэтому исследователи сравнили гены MdSWEET яблони домашней с генами резуховидки — AtSWEET. Ранее было показано, что белки и, соответственно, гены SWEETрезуховидки по строению можно разделить на 4 клады. Белки из клад I, II и IV в основном транспортируют шестиатомные сахара (фруктозу, глюкозу и сорбит). Белки SWEET из третьей клады специализируются на транспорте более крупной молекулы — сахарозы. Исходя из сходства строения генов яблони и резуховидки исследователи построили филогенетическое дерево, характеризующее родство генов яблони между собой и с генами резуховидки (рис. 4). Как и ожидали исследователи, SWEET-гены яблони так же хорошо разделяются на 4 структурно (и, судя по всему, функционально) различающиеся клады.
Рис. 4. Родство между всеми SWEET-генами яблони домашней (имеют префикс Md в названии) и резуховидки Таля (префикс At). Рисунок из обсуждаемой статьи в Horticulture Research
Исследователей интересовало то, какие из обнаруженных ими в геноме яблони генов сильнее всего задействованы в формировании вкусовых качеств плода. Чтобы сузить спектр подозреваемых генов, они случайным образом выбрали два сорта яблок (K9 и Shishan 2) и проследили активность всех 25 SWEET-генов на разных стадиях роста яблони и созревания плодов. В результате было обнаружено 9 SWEET-генов, активность которых сильно возрастает именно в период созревания яблок.
Теперь, когда подозреваемых стало поменьше, исследователи смогли проанализировать генотипы 188 сортов яблок по заданным участкам с SWEET-генами. Четыре из девяти генов имели по два возможных аллеля, то есть по две формы одного и того же гена. Для диплоидного организма (коим и является яблоня), это означает теоретическую возможность существования трех генотипов: когда на обеих хромосомах, составляющих пару (имеющих один и тот же номер), имеется первый аллель (гомозигота по первому аллелю); когда на обеих хромосомах имеется второй аллель (гомозигота по второму аллелю); когда на одной из хромосом первый аллель, а на другой — второй (гетерозигота). Для одного из генов, имеющих два аллеля (MdSWEET15а), теория не совпала с реальностью: среди всех исследованных яблонь оказалось лишь два генотипа, а гомозигота по одному из аллелей почему-то не встречается. У других пяти SWEET-генов оказалось по три аллеля, что дает уже шесть возможных генотипов. Тут тоже оказалось одно исключение: ген MdSWEET9b представлен в выбранных сортах только 4 генотипами. Учитывая, что исследователи работали с деревьями, которые уже не один год плодоносят, наиболее правдоподобное объяснение этим исключениям состоит в том, что они появились в результате отбора (селекции). Несмотря на то, что у аллелей есть возможность случайно встретиться в новом организме, этот новый организм либо оказывается нежизнеспособным и погибает, либо дает заметно худший урожай и потому дерево быстро уничтожают.
На следующем этапе авторы статьи произвели тщательную проверку зрелых яблок всех 188 сортов с целью выявить все возможные различия в общем количестве твердых растворимых веществ в яблоке, в общем количестве сахара и в количестве каждого из сахаров (фруктозы, сахарозы, глюкозы и сорбита) по отдельности. Проанализировав по несколько десятков яблок с каждого дерева, исследователи выяснили, что больше всего в яблоках фруктозы (30,5–83,8 мг/г в мякоти свежего яблока), далее идет сахароза (3,8–41,8 мг/г) и глюкоза (3,9–31,8 мг/г), а меньше всего в зрелом яблоке сорбита (0,1–22,6 мг/г). Всего в среднем яблоке оказалось 89,9 мг/г сахаров.
Данные по всем сортам исследователи соотнесли с генотипами изучаемых яблонь и выяснили, что из девяти подозреваемых SWEET-генов только три дают значительный вклад в содержание в яблоке сахаров (рис. 5). Так, ген MdSWEET2е дает 3,6% изменчивости общего содержания сахаров, 2,7% изменчивости по содержанию в зрелом яблоке фруктозы и 0,7% — сахарозы. У этого гена есть три аллеля: (АТ)13, (АТ)7 и (АТ)17. Гомозигота по одному из них, а именно генотип, обозначенный (АТ)13/13, имеет большее количество сахаров (фруктозы и сахарозы, в частности), чем другие генотипы по этому гену.
Рис. 5. Среднее количество сахаров в зависимости от генотипа по трем генам: MdSWEET2е, MdSWEET9b и MdSWEET15а. Показано (в процентах): общее количество твердых растворимых веществ (SSC); общее количество сахаров (Total sugar content); количество сахарозы (Sucrose content), фруктозы (Fructose content), глюкозы (Glucose content) и сорбита (Sorbitol content) в мг/г мякоти свежего яблока. Рисунок из обсуждаемой статьи в Horticulture Research
Ген MdSWEET9b определяет общее содержание сахаров на 2,5%, а количество фруктозы — на 6,6%. В этом случае гомозигота по одному из трех имеющихся аллелей ((СТ)19, (СТ)23 и (СТ)26) с генотипом (СТ)19/19, имеет значимо более высокое количество фруктозы и сахаров в целом.
Наиболее «влиятельным» оказался ген MdSWEET15а: от него на 6,4%, 8,4%, 6,8% и 5,7% зависит содержание в яблоке всех твердых растворимых веществ, общего количество сахаров, количество глюкозы и сорбита соответственно. У гетерозиготы, обозначенной (Т/С), все перечисленные показатели значимо выше, чем у гомозиготы (С/С).
Результаты обсуждаемого исследования в сочетании с методами селекции могут помочь значительно ускорить выведение новых сортов яблок — как без применения генной инженерии, так и в сочетании с ней. Два из выявленных генов-переносчиков сахаров, чья работа значительно отражается на качестве яблока (MdSWEET15а и MdSWEET9b), относятся к третьей кладе SWEET-генов и с наибольшей вероятностью занимаются транспортом именно сахарозы, чаще всего используемой для переноса питательных веществ на относительно дальние расстояния в растениях. Третий же ген, MdSWEET2е, из первой клады и он скорее переносит сорбит, однако из всей троицы именно он в наибольшей степени влияет на содержание в яблоке собственно сахарозы, а не продуктов ее распада — фруктозы и глюкозы. Но несмотря на успехи ученых, как всегда, еще многое остается изучить и понять.
Источник: Qiaoling Zhen, Ting Fang, Qian Peng, Liao Liao, Li Zhao, Albert Owiti & Yuepeng Han. Developing gene-tagged molecular markers for evaluation of genetic association of apple SWEET genes with fruit sugar accumulation // Horticulture research. 2018. DOI: 10.1038/s41438-018-0024-3.
Алёна Сухопутова